慶應大学　吉村研究室

 最近の成果

SOCSはさまざまな疾患で発現が上昇したり減少したりすることが報告されており、我々はSOCSによる病態の理解を促進するためにcKOマウスを世界中に送付している。今後様々なモデル疾患でSOCSの意義が明らかにされるであろう。またこれらの解析を通じて、SOCS/STATによる免疫調節の実態が深く理解され将来的にはアレルギー、自己免疫疾患、癌の免疫療法などの画期的な治療法の開発につながることを期待したい。

　Spred-1はヒト神経繊維腫症の原因遺伝子であることが明らかにされた。この疾患では頭蓋形成の異常、白血病の増加、学習障害などさまざまな病態が報告されている。今後Spred-1欠損マウスを活用することでこれらの原因の詳細が理解されるであろう。また世界的にもこの分野の研究者から多くの関心を集めることになるだろう。Spred-1と免疫疾患はまだ報告されていない。しかし我々はSpred-1欠損マウスで好酸球増多症によるアレルギー性疾患の増悪化を報告しており、Ras-ERK経路はどのような細胞においても重要な役割を果たすことから、免疫分野でも新たな展開が期待できる。

　残念ながらFoxp3プロモーターの解析やIL-17プロモーターの解析では一歩で遅れたが、これらのツールは数十カ所以上の施設からリクエストが来ており多くの共同研究をスタートしている。特にケミカルライブラリーのスクリーニングによってTh17を抑制したりTregを増強あるいは抑制したりする薬剤の開発が期待できる。

（１）SOCSのTh17分化における機能解明

近年Th1/2に加えて誘導性Treg(iTreg)やTh17などTh細胞の新たなサブセットについての報告・知見が集積してきており、免疫の恒常性維持もしくは破綻はこれらの様々なTh細胞群のバランスにより生じるのではないかと考えられるようになってきている。T細胞特異的にSOCS1やSOCS3を欠損したcKOマウスを作製し、Th17に依存する実験性自己免疫性脳脊髄炎モデル(EAE)を施行した。その結果SOCS1-cKOではEAEは抑制され、逆にSOCS3-cKOでは増強された。様々な生化学的解析からSOCS1はIFNγのシグナルを抑制することでTh17促進に、SOCS3はIL-6やIL-23を抑制することでTh17抑制に作用することを明らかにした（Pro.NAS,USA2007, J.Immunol.2008）。さらにSOCS1欠損においてはTGFβ-Smadの活性化が抑制されていることも明らかにした。これにもIFNγ/STAT1が重要でありSTAT1が未知の機構を介してSmadを抑制している実態が明らかとなった。このスキームを右図に示す。

（２）SOCSのTreg分化における機能解明

抑制性のヘルパーT細胞としては胸腺由来のnTregの他、最近TGFβによって誘導されるiTregが注目されている。SOCS3欠損T細胞ではTGFβやIL-10の産生が高くSOCS3はT細胞において抑制性T細胞の分化を制御する可能性が示された（J.Exp.Med.2006)。しかしSOCS3欠損T細胞ではnTregの分化は正常であり、むしろiTregが影響を受けている可能性がある。今後この点についてはさらに解析を続けたい。一方SOCS1欠損T細胞ではnTregが胸腺ですでに２倍以上に増加している（Immunity 2009)。現在このメカニズムを明らかにすべくFoxp3-CreによってTreg特異的にSOCS1を欠損させるマウスを作製中である。

　我々はSOCS3欠損樹状細胞の解析を通じてTGFβがFoxp3陽性Tregのexpansionに極めて重要であることを発見し報告した(J.Immunol.2007)。SOCS3欠損樹状細胞は試験管内においても生体内においても、未熟な性質を保っており、Foxp3陽性Tregを選択的に増加させることを明らかにした。すなわちSOSC3欠損樹状細胞は抑制性T細胞を産み出す、寛容誘導型の樹状細胞であると言える。この原因を明らかにするために、種々のサイトカイン抗体を加えてT細胞の分化に及ぼす影響を調べた。その結果、Foxp3陽性T細胞の増加は、抗TGFb抗体および抗IL-2抗体により遮断された。抗IL-2抗体はエフェクターT細胞への分化も抑制するが抗TGFβ抗体はFoxp３陽性細胞の分化に選択的に強く影響した。そこで樹状細胞からのTGFβの産生を比較したところ、SOCS3欠損樹状細胞が野生型樹状細胞に比べてTGFbを多く産生した。以上のことからSOCS3がSTAT3を介してTGFβの産生を制御することが示唆された。これらの結果から、TGFβがFoxp３陽性Tregの誘導に必須であること、およびSOCS3は樹状細胞が免疫応答を引き起こすか免疫寛容を引き起こすかの決定に重要であることが示された(右図）。

（３）SOCSと炎症性発がんの関係

　SOCS研究の過程でSOCS1欠損マウスに大腸がんが自然発症すること(J.Exp.Med.2006）およびヒト肝臓がん(HCC)でSOCS1の遺伝子サイレンシングが高頻度で見られること(J.Exp.Med.2005),SOCS3タンパクの発現が癌部で低いこと(Gastroenterology 2007）などからSOCSと炎症性発がんに関心をもち、cKOマウスを用いた解析を行った。その結果肝臓特異的にSOCS1を欠損させることでSTAT1やJNKの強い活性化と肝炎の増悪化が認められた(Hepatology, 2008)。逆にSOCS3を欠損させるとSTAT3が強く活性化され肝炎が抑制された(Gastroenterology 2007)。これらの結果から右図のような炎症と発がんに関する２step-modelを発表した（Nature Rev. Immunol.2007)。

（４）新規免疫抑制物質の探索と機能解明

我々は樹状細胞を生きた繊維芽細胞とco-cultureするとLPSによる樹状細胞の成熟が強く抑制され、T細胞の活性化も抑制されることを見いだした。精製の結果、繊維芽細胞から産生される、TNFやIL-12産生の抑制因子はプロスタグランジンE2（PGE2)であった(Int. immunol.2008)。

　PGE2は細胞内cAMP 濃度の上昇を介して樹状細胞からのTNFやIL12産生を抑制する。本研究ではcAMPによって誘導される遺伝子に注目して、cAMPの抑制作用の本体の同定を行った。まずタンパク合成阻害剤シクロヘキシミドの効果からcAMPが抑制効果を発揮するためには新規タンパク合成が必要と考えられた。そこでマイクロアレイ解析を行った結果、我々はc-fosをcAMPによる抑制効果を担う因子の候補として同定した。c-fos遺伝子をマクロファージ系の細胞(Raw細胞)に強制発現することでLPSによるTNFαの誘導を強力に抑制することができた。逆にsiRNAによりc-fos発現を抑制するとcAMPの抑制効果が失われた。さらに我々はLPSまたはcAMP単独刺激と比較してLPS+cAMP共刺激によって、c-Fos タンパク質レベルが極めて増加することを見いだした。

　次に我々はc-Fosの炎症性サイトカイン産生抑制機構を解析した。c-FosはNF-kB p65　サブユニットと物理的に相互作用することによって、p65ホモダイマーのTNFaプロモーターやIL-12プロモーターへのリクルートを阻害していた。またcAMPによってc-fosのmRNAが発現誘導され、TLRの下流で活性化されたIKKbがc-Fosを直接リン酸化することによって、c-Fosの安定化と蓄積を引き起こすことがわかった。c-Fosの複数箇所がIKKbによってリン酸化を受けるが、c-Fosの308番目のセリン残基がIKKbによるリン酸化と安定化に必要な残基の一つであることを明らかにした。これらの結果から、我々はc-FosがIKKbの新規基質であること、およびcAMPによる免疫抑制効果を担う因子であると結論づけた。以上の本研究成果は2009年Immunity誌に掲載された(2009)。

（５）TGF-β/Smadによる免疫抑制作用の解析

Foxp3プロモーターの解析からSmadによるFoxp3の転写制御の機構を明らかにした。Smadは直接プロモーターに会合する(J.Biol.Chem.2008)。現在Smad2/3欠損マウスを作製しSmadによる免疫制御の実態解明を行っている。

（６）Spred1が家族性神経細胞腫の原因遺伝子であることの発見

ベルギー、フランス、アメリカとの国際共同研究において、カフェオレ斑を持つが、NF1遺伝子に変異を認めない家族性優性遺伝の神経線維腫症1型様患者での解析を行った。その結果ヒトSPRED1に多数の変異を発見し報告した。SPRED1はneuro-cardio-facial-cutaneous (NCFC)症候群の原因遺伝子の一つであり、Ras経路を抑制する新しい癌抑制遺伝子の候補であることが示唆された(Nature Genetics 2007)。

発表論文

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国際学会招待講演

2006/6/18-21 Physiological functions of the Sprouty/Spred family proteins,negative regulators for the Ras/ERK pathway BEATSON INTERNATIONAL CANCER CONFERENCE Glasgow, UK

2006/5/28-6/2 Regulation of osteoclastgenesis by inflammatory cytokines and SOCS. 1st International Conference on Osteoimmunology Ist International meeting of osteoimmunology Crete Greek

2007/1/5-10 SOCS1 and SOCS3 are Critical Regulators of Cytokine Signaling; Implication for Helper T Cell Differentiation and Tumor Development. KEYSTONE SYMPOSIA on Molecular and Cellular Biology Keystone USA

2007/3/29-31 SOCS1 is a link between inflammation and inflammation-mediated carcinogenesis. 5th International  Aachen Symposium on Cytokine Signalling, Aachen Germany